TEKNIK PEMURNIAN ENZIM/ PROTEIN
MENGGUNAKAN METODE DIALISIS,
ELEKTROFORESIS DAN KROMATOGRAFI
1.
Dialisis
Dialisis adalah
suatu teknik pemisahan
dengan cara menggunakan
membran yang memisahkan dua fasa cairan. Membran tersebut
bersifat semipermeabel terhadap partikel
solute. Partikel solut
berpindah melalui membran
ke larutan dengan konsentrasi
rendah. Dialisis digunakan
untuk memisahkan garam-garam
dari suspensi dalam biokimia
dengan tujuan mencegah koagulasi.
Dialysis adalah metode pemisahan molekul besar (seperti pati atau
protein) dari molekul
kecil (seperti glukosa
atau asam amino)
dengan difusi selektif
melalui membrane semipermeabel. Misalnya,
jika larutan campuran
pati dan glukosa dimasukkan dalam wadah tertutup
terbuat dari bahan semipermeabel
(seperti selofan) lalu direndam
dalam gelas kimia berisi air, maka molekul glukosa yang lebih kecil akan
melewati membrane menuju ke
air, sedangkan molekul
besar, yaitu pati, akan
tertinggal di dalam wadah. Prinsip dasar dari dialisi ini
adalah perbedaan molekul-molekul. Alat yang digunakan yaitu wadah tertutup terbuat dari bahan
semipermeabel (sperti selofun), gelas piala. Dialysis ini
digunakan untuk memisahkan
molekul-molekul yang memiliki
perbedaan ukuran. Membrane sel pada makhluk hidup bersifat
semipermeabel, dandialysis berlangsung secara alami dalam
ginjal untuk mengeluarkan
limbah bernitrogen. Ginjal
buatan (mesin dialysis) menggunakan asas ini untuk menggantikan
fungsi ginjal sakit.
Selaput semipermeabel
Partikel
Zat terlarut air masuk
Partikel
koloid
2.
Elektroforesis
Elektroforesis adalah
teknik pemisahan komponen
atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik. Hasil
dari berbagai manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui
proses elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang
bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik.Elektroforesis memanfaatkan
muatan listrik yang
ada pada makromolekul.
Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui
suatu medium, kemudian dialiri arus
listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul
tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.
Teknik ini dipelopori
pada tahun 1937
oleh ahli kimia Swedia
Arne Tiselius untuk
pemisahan protein.
Sekarang telah meluas
ke banyak pemisahan
kelas yang berbeda
lain dari biomolekul termasuk
asam nukleat, karbohidrat dan asam amino. Menurut Andrews (1993),
elektroforesis merupakan teknik yang umum digunakan untuk analisis DNA dan protein. Melalui teknik ini dapat
ditentukan:
1.
Berat molekul suatu bahan
2.
Banyaknya jenis protein pada suatu sampel
3.
Adanya pemalsuan bahan atau kerusakan/kontaminasi bahan
4.
Adanya antibodi terhadap virus atau bakteri pathogen tertentu
5.
Titik isoelektrik protein
Hartati
dan Lisdiyati (1997) menyebutkan terdapat dua macam macam teknik elektroforesis
yang telah berkembang yaitu,
elektroforesis horizontal maupun
vertikal. Sedangkan menurut
Suranto (2002), berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:
1. Elektroforesis bebas
(free electrophoresis): molekul
atau partikel yang
akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus
listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas
di antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona:
merupakan jenis elektroforesis yang paling
banyak digunakan,
mempergunakan media penunjang,
seperti kertas, selulosa
asetat, agarosa atau poliakrilamid.
Peralatan untuk
elektroforesis secara umum terdiri dari 2 komponen utama, yaitu power supply
sebagai sumber arus
listrik tangki elektroforesis.
Untuk
menghantarkan listrik, gel
diletakkan dalam suatu
bufer. Bufer yang
sama digunakan untuk
membuat gel (Tchin
et al., 2011).
Untuk pewarnaan digunakan
Ethidium Bromida, suatu
zat pewarna yang
dapat menyisip/interkalasi di antara basa
DNA pada dua
utas DNA yang
berlainan. Ethidium Bromida
(EtBr) akan berpendar
di bawah paparan
sinar UV (Lepais
and Bacles, 2011).
Pewarna ini dapat
ditambahkan pada gel
dan bufer sehingga tidak perlu
melakukan staining sesudah proses elektroforesis. Keuntungannya adalah lebih
praktis, tetapi kemungkinan
kontaminasi EtBr lebih
besar. EtBr adalah
zat yang bersifat karsinogenik sehingga harus dihindari kontak
langsung (Andrews, 1993). Untuk
analisis DNA gel yang
digunakan adalah agarosa, suatu polisakarida
(Allen et al.,
1984). Elektroforesis yang dilakukan adalah sistem horizontal. DNA yang
bermuatan negatif akan bergerak ke arah
kutub positif melalui molekul-molekul agarosa (Hartatidan Lisdiyati, 1997).
Selain agarosa, gel poliakrilamid
juga dapat digunakan
untuk memisahkan DNA,
terutama untuk fragmen
yang berukuran kecil
(antara 5 bp-<1
kb), misalnya untuk
sekuensing (Lepais and
Bacles, 2011).
3.
Kromatografi
Kromatografi
adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkanperbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase
gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang
memiliki ikatan yang
kuat dengan kolom
akan cenderung bergerak
lebih lambat dibanding molekul
yang berikatan lemah.
Dengan ini, berbagai
macam tipe molekul
dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen
terelusi dari kolom, komponen tersebut
dapat dianalisis dengan
menggunakan detektor atau
dapat dikumpulkan untuk
analisis lebih lanjut.
Berdasarkan bahan dan peralatan yang digunakan kromatografi dibedakan
menjadi 4 jenis, antara lain :
1. Kromatografi Kertas (Paper Chromatography)
Kromatografi kertas
merupakan salah satu
metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu
senyawa pada dua
fasa yaitu fasa
diam dan fasa
gerak. Pemisahan sederhana
suatu campuran senyawa
dapat dilakukan dengan
kromatografi kertas, prosesnya
dikenal sebagai analisis
kapiler dimana lembaran
kertas berfungsi sebagai pengganti kolom. Kromatografi kertas
adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai
padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu
disebut kromatografi kertas.
Sebagai fasa diam
adalah air yang
teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang
biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.
Dalam kromatografi kertas
fasa diam didukung
oleh suatu zat
padat berupa bubuk
selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang
teradsorpsi dalam selulosa
kertas.fasa gerak berupa
campuran pelarut yang
akan mendorong senyawa
untuk bergerak disepanjang kolom
kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan
cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume
retention (VR).
Harga Rf
zat baku dapat
diidentifikasikan komponen campuran,
karena harga besaran ini
bersifat khas untuk
setiap zat asal
digunakan jenis pengembang
yang sama. Kadang-kadang
pemisahan dalam satu
arah belum memberikan
hasil yang memuaskan. Untuk
mendapatkan hasil yang
lebih baik, dapat
dipakai cara kromatografi
kertas dua dimensi, yang
mana letak kertas
diubah sehingga arah
pemisahan juga berubah. Secara
umum kromatografi kertas
dilakukan dengan menotolkan
larutan yang berisi sejumlah komponen
pada jarak 0,5
sampai 1 cm
dari tepi kertas.
Setelah penetesan larutan
pada kertas, maka
bagian bawah kertas
dicelupkan dalam larutan pengambang(developing solution). Larutan ini
umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan
dengan air. Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat
sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat
diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan,
sistem secara keseluruhannya disimpan
dalam tempat tertutup,
ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.
Description: teknik pemurnian enzim
Reviewer: Unknown
Rating: 4.0
ItemReviewed: teknik pemurnian enzim
Reviewer: Unknown
Rating: 4.0
ItemReviewed: teknik pemurnian enzim
Tidak ada komentar: